甲氧苄啶的作用机制主要是可逆性抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸还原为四氢叶酸的过程受阻，影响微生物DNA、RNA及蛋白质的合成，阻断叶酸代谢，抑制细菌核酸蛋白合成。
甲氧苄啶是细菌二氢叶酸还原酶抑制剂，属磺胺增效药，用于对其呈现敏感的大肠埃希菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和某些肠杆菌属、腐生葡萄球菌等细菌所致的急性单纯性下尿路感染的初发病例。甲氧苄啶的抗菌作用原理为干扰细菌的叶酸代谢，可以选择性抑制细菌的二氢叶酸还原酶的活性，使二氢叶酸不能还原为四氢叶酸，抑制细菌的生长繁殖。甲氧苄啶可用于治疗敏感菌所致的中耳炎、伤寒、菌痢、败血症、脑膜炎等，但细菌较易产生耐药性，很少单独使用。
甲氧苄啶可分泌至乳汁中，其浓度较高，且药物有可能干扰哺乳婴儿的叶酸代谢，所以哺乳期妇女必须权衡利弊后决定是否用药，用药期间应定期进行周围血象检查，出现异常需要及时就诊，及时调整治疗方案。肝功能损害以及叶酸缺乏引起的巨幼细胞贫血或其他血液系统疾病，肾功能损害的患者应慎用该药物。
